Vyšetřování mozkomíšního moku (Doporučení č. 6)

České společnosti klinické biochemie ČLS JEP (ČSKB), Referenční laboratoře MZ pro klinickou biochemii (RL), Sekce pro neuroimunologii a likvorologii České neurologické společnosti ČLS JEP a Sekce laboratorní imunologie České společnosti pro alergologii a klinickou imunologii ČLS JEP (ČSAKI)

Revize 2005
Schváleno:
výborem ČSKB dne 8.12.2005
výborem ČSAKI dne 9.2.2006

Toto doporučení je zdrojem informací pro laboratoře zabývající se likvorovou diagnostikou. Cílem dokumentu je snaha o optimalizaci preanalytické i vlastní analytické fáze. Z níže uvedených analytických zkoušek se klade důraz na dostupné, pokud možno validované postupy. Toto doporučení bude revidováno v závislosti na vývoji nových poznatků v oblasti likvorologie a neuroimunologie.

Doporučení k vyšetření mozkomíšního moku (likvoru) se týká jak statimových (biochemických a cytologických) tak speciálních analýz, nezahrnuje mikrobiologické vyšetření likvoru. Pracoviště provádějící vyšetření likvoru musí splňovat technické a personální požadavky podle doporučení stanovených odbornými společnostmi.


Technické a personální požadavky:

1. Získání certifikátu od České společnosti pro klinickou cytologii k provádění cytologických vyšetření likvoru.

2. Platné osvědčení o účasti v systémech externího hodnocení kvality (EHK) zaměřené na analýzu likvoru (s ohledem na dokument "Certifikace", schváleného odbornými společnostmi pro příslušný kalendářní rok).

3. Minimální počet likvorových analýz by měl být 100 za kalendářní rok, laboratoře s nižším počtem vyšetření by pak měly být metodicky napojeny na laboratoř provádějící likvorologickou diagnostiku v počtu vyšším než 200 analýz ročně. Metodickým napojením se rozumí nejméně edukace pracovníků 1x ročně.

Poznámka: Předpokladem pro získání certifikátu od České společnosti pro klinickou cytologii k provádění cytologických vyšetření likvoru je úspěšné absolvování zkoušky, při které uchazeč analyzuje cytologické preparáty mozkomíšního moku (appendix 1).

A/ Preanalytická fáze

Odběr:

Likvor - standardní zkumavky bez protisrážlivých prostředků.

Krev - standardní zkumavky bez protisrážlivých prostředků (sérum), použití separačních gelů a akcelerátorů srážení je možné.

Krev na vyšetření laktátu - zkumavky s protisrážlivým a antiglykolytickým prostředkem (EDTA/NaF, heparin litný/monojodacetát)

Odběr krve má být proveden cca 30 minut před odběrem likvoru.

Zpracování:

K cytologickému vyšetření a stanovení počtu elementů je nutné použít nativní necentrifugovaný likvor do 3 hodin po odběru.

K biochemickému vyšetření je možné použít likvor, který je zcentrifugovaný do 3 hodin po odběru, ale pro spektrofotometrické vyšetření se doporučuje centrifugovat mozkomíšní mok do 1 hodiny po odběru.

Materiál (tj. likvor po oddělení případné korpuskulární fáze) k následnému speciálnímu vyšetření likvoru je nutné předat specializovanému pracovišti nejpozději do 3 dnů.

Skladování:

Centrifugovaný likvor a sérum lze skladovat pro dodatečné analýzy (zejména stanovení specifických proteinů):

< 1 týden při teplotě +4 až +8 oC

< 1 rok při teplotě –20 °C, opakovaně nerozmrazovat

> 1 rok při teplotě -70 °C, opakovaně nerozmrazovat

Laboratoř provádějící vyšetření likvoru musí zajistit provedení těchto analýz statimově:

1. Vzhled likvoru

2. Stanovení celkvé bílkoviny kvantitativně

3. Stanovení glukózy

4. Stanovení laktátu

5. Kvantitativní cytologické zhodnocení

6. Kvalitativní cytologické zhodnocení

7. Spektrofotometrie likvoru

Výsledek statim je nutné vydat do 1 hodiny po přijetí materiálu v laboratoři.

Další doporučená speciální vyšetření likvoru dle typu pracoviště:

8. Stanovení IgG, IgA, IgM a albuminu v séru a likvoru s odhadem intratékální syntézy imunoglobulinů a stanovením funkce hemato-likvorové bariéry

9. Izoelektrická fokusace se specifickou imunodetekcí oligoklonálních pásů IgG

10. Detekce likvorey

11. Cytologické preparáty barvené na lipidy, nukleoly, železo (Fe3+)

12. Stanovení dalších proteinů v likvoru a séru

B/ Analytická fáze

Doporučené metodické postupy prováděných vyšetření likvoru:

1. Vzhled likvoru: hodnocení se provádí před a po centrifugaci likvoru

2. Stanovení celkové bíkoviny: benzethonium chlorid nebo pyrogallolová červeň

3. Stanovení albuminu: imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie

4. Stanovení IgG: imunonefelometrie

5. Stanovení IgM, IgA: imunonefelometrie s latexovými částicemi

6. Stanovení dalších specifických proteinů: imunoanalytické metody s vysokou analytickou citlivostí (LIA, RIA, IRMA, ELISA, imunonefelometrie atd.)

7. Stanovení glukózy: GOD – POD fotometricky nebo GOD elektrochemicky nebo metodou s hexokinázou

8. Stanovení laktátu: LOD – POD fotometricky nebo UV fotometricky nebo LOD elektrochemicky

9. Kvantitativní cytologické zhodnocení: ve Fuchsově-Rosenthalově komůrce, počet jaderných elementů po obarvení kyselým fuchsinem popř. jiným barvivem zdůrazňujícím jaderné elementy (toluidinová modř) a počet erytrocytů bez obarvení

10. Kvalitativní cytologické zhodnocení : cytologický preparát, základní barvení:

dle Pappenheima (May-Grünwald, Giemsa-Romanowski) nebo dle Papanicolaoua

11. Cytologický preparát k průkazu lipidů, nukleolů, železa (Fe3+): speciální barvicí techniky

12. Spektrofotometrie likvoru: ve viditelném spektru stanovení oxyhemoglobinu, methemoglobinu a bilirubinu s vyloučením hyperbilirubinémie

13. Odhad intratékální produkce imunoglobulinů podle Reibera: graficky odečtem z příslušného diagramu nebo numericky výpočtem z Reiberovy rovnice (podrobnosti jsou dostupné na https://www.sekk.cz/)

14. Izoelektrická fokusace oligoklonálních IgG pásů s imunodetekcí: imunofixace nebo imunoblot

15. Detekce likvorey: imunonefelometrické stanovení β-trace proteinu (L-prostaglandin D syntáza) nebo izoelektrická fokusace s imunodetekcí β-2-transferinu nebo β-trace proteinu


C/ Požadované analytické znaky vybraných metod v likvorologii

Analytické vlastnosti:

V tabulce 1 jsou uvedeny u vybraných likvorových metod (celková bílkovina, albumin, glukóza, laktát, IgG, IgM a IgA) některé analytické znaky (reprodukovatelnost, bias a toleranční limity) dle doporučení společnosti Deutsche Gesellschaft für Liquordiagnostiks und Klinische Neurochemie, kterou vede prof. Reiber v Německu (tj. doporučená kriteria kvality dle Rilibäk pro rok 2004, dostupné například na:

https://www.uke.uni-hamburg.de/extern/dgln/qualitaetskontrolle.htm).


Kalibrační materiál:

Doporučený kalibrační materiál pro likvorové metody je součástí souprav výrobců, pouze u metody glukóza a laktát je vhodný i běžně používaný sérový kalibrátor.


Kontrolní materiál:

Doporučený kontrolní materiál uvádí appendix 2.

Tab. 1 Požadované analytické znaky vlastnosti vybraných metod v likvorologii

metoda

celková bílkovina

albumin

glukóza

laktát

IgG

IgM

IgA

CV [%]reprodukovatelnost
dle Rilibäk 2004

8,00

8,00

5,00

7,00

7,00

9,00

10,0

bias [%]
dle
Rilibäk 2004

8,00

8,00

6,00

7,00

7,00

9,00

10,0

toleranční limity [%]
dle
Rilibäk 2004

27,0

27,0

18,0

23,0

24,0

31,0

32,0

doporučený kalibrační materiál

součástí použitého setu

běžně používaný sérový

součástí použitého setu

doporučený kontrolní materiál

speciální likvorový nebo močový

běžně používaný sérový, speciální likvorový, močový (glukóza)

speciální likvorový


Literatura - viz appendix 3.

Na 1. revizi doporučení pracovali:

Doc. MUDr. Adam Pavel, CSc., RNDr. Andrýs Ctirad, PhD., RNDr. Friedecký Bedřich, Ph.D., MUDr. Kalla Karel, RNDr. Ing. Kelbich Petr, RNDr. Král Vlastimil, CSc., MUDr. Marečková Helena, CSc., MUDr. Mrázová Kateřina, Ing. Ženková Jana

Appendix 1

Získání odborné způsobilosti v oblasti cytologie likvoru

Odbornou způsobilost v oblasti cytologie likvoru získává vysokoškolák pracující na pracovištích klinické biochemie ověřením znalostí před komisí jmenovanou katedrou patologie IPVZ.

Obor patologie je garantem morfologických vyšetření. Zkušební komise je tříčlenná.

Uchazeč o ověření znalostí se hlásí na katedru patologie IPVZ. Pokud se sejde alespoň cca 5 uchazečů, stanoví se termín zkoušky tak, aby jej uchazeč měl k dispozici s šestitýdenním předstihem.

Zkouška sestává ze dvou teoretických otázek týkajících se cytologie likvoru, ohodnocením buněk na promítaných obrázcích (dia) a zhodnocením preparátů.

Po úspěšném složení zkoušky obdrží uchazeč od IPVZ osvědčení o odborné způsobilosti v oblasti cytologie likvoru.

Appendix 2

Kontrolní materiál

Doporučený kontrolní materiál pro metodu celková bílkovina, albumin je likvorový nebo močový např. BIORAD (Liquichek Spinal Fluid Control, Liquichek Urine Chemistry Control), DADE BEHRING (N/T Protein Control LC), MAS CSF a UrichemTRAK (dodává firma MEDISTA), RANDOX (CSF Control – assayed, Urine Control – assayed), popř. kontrolní materiál dodávaný v soupravách výrobců.

Pro glukózu je vhodný běžně používaný sérový kontrolní materiál, kterých je na trhu velký výběr, močový nebo likvorový např. BIORAD (Liquichek Spinal Fluid Control, Liquichek Urine Chemistry Control), MAS CSF a UrichemTRAK (MEDISTA), RANDOX (CSF Control – assayed, Urine Control – assayed) a další.

Pro laktát je vhodný též jako pro glukózu běžně používaný sérový kontrolní materiál nebo likvorový např. BIORAD (Liquichek Spinal Fluid Control), MAS CSF (MEDISTA), RANDOX (CSF Control – assayed)

Pro likvorové metody IgG, IgM a IgA je doporučován kontrolní likvorový materiál výrobců souprav např. DADE BEHRING (N/T Protein Control LC) nebo dalších firem dodávajících likvorovou kontrolu kvality např. BIORAD (Liquichek Spinal Fluid Control), MAS CSF (MEDISTA), RANDOX (CSF Control – assayed).

Appendix 3

Literatura

  1. Adam P.: Cytologie likvoru, Pardubice, Stapro, 1995.
  2. Lamers K.J.B., Wevers R. A.: Cerebrospinal Fluid Diagnostics: Biochemical and Clinical Aspects. Klin.Biochem.Metab.,24,1995, 2, s. 63-75.
  3. Felgenhauer K.: Laboratory Diagnosis of Neurological Diseases. In: Thomas L.(ed.): Clinical Laboratory Diagnostics. Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Frankfurt/Main, TH-Books Verlagsgesellschaft mbH 1998, s. 1308-1326.
  4. Masopust J.: Klinická biochemie. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Praha, Karolinum, 1998, s.667-690.
  5. Glosová L.: Cytologický atlas mozkomíšního moku, Galén 1998.
  6. Adam P., Táborský L., Sobek O., Hildebrandt T., Kelbich P., Průcha M., Hyánek J.: Cerebrospinal Fluid. Advances in Clinical Chemistry 2001, 36:1-62.San Diego, San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Academic Press 2001.
  7. Adam P.,Táborský L., Sobek O., Kelbich P., Průcha M.: Proteinologie mozkomíšního moku. Praha, Medica News Publishers 2002.
  8. Zima T. et al.: Laboratorní diagnostika, Galén, Praha 2002, s. 363-388.
  9. Adam P., Táborský L., Sobek O., Kelbich P.: Cytology of Cerebrospinal Fluid.Praha, Medica News Publishers 2003.
  10. Racek J. et al.: Klinická biochemie , 2.vydání, Galén a Karolinum, Praha, 2006.